如假包換—新冠SEM仿真病毒養成記

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)自2019年底席捲全球各地,截至2022年四月底為止,全球確診病例數已達五億一千萬以上,更造成六百多萬的死亡案例。隨著感染人數的增加,新冠病毒更演化出各式不同之變異株(variant),各國政府及研究團隊因而積極投入藥物及疫苗的開發;其中,棘蛋白(Spike protein, S)的突變對新冠病毒傳染力的影響最受科學家們關注,例如:Omicron變異株造成突破性感染。棘蛋白是冠狀病毒最明顯的結構蛋白,也是與宿主細胞進行連結的最主要橋樑。當S蛋白與宿主細胞表面的血管收縮素轉化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)結合後,會被細胞膜上的蛋白酶進行切割活化,促使病毒膜與細胞膜的融合,進而感染宿主細胞。目前已知ACE2在人類呼吸道及肺泡細胞都有表現,使得新型冠狀病毒能經由飛沫傳播並具高度傳染性(圖A)。

真實病毒vs. 偽病毒
此類高傳染性病毒在管制分類上屬於第三級危險群(RG3)病原體,必須在P3等級以上的實驗室進行,因此相關的實驗成本所費不貲。此外,國內P3等級以上實驗室及具備操作資格的人員有限,加上實驗環境軟硬體的限制、活病毒株培養、操作上具高風險等條件,均不利於藥物及疫苗的研發。在疫情爆發之前,偽病毒(pseudotyped virus)之原理與技術早已廣泛地使用於病毒血清學、疫苗中和測試與新興病毒的研究,比起具有高致病性及複製能力的真實病毒,偽病毒具相對安全性,且於P2等級以上之實驗室即可進行操作。

本院感染症與疫苗研究所(簡稱感疫所)余佳益副研究員研究團隊選擇以反轉錄病毒之特性作為技術之核心,搭配冷光報導基因以及新冠病毒的S蛋白,組裝出擁有病毒結構外殼但不具複製能力的偽病毒顆粒,且可透過偵測攜帶的冷光報導基因的冷光素酶活性,作為偽病毒感染效力的指標。在研發偽病毒的初期,以相同的製程方式產出SARS-CoV(2003年SARS疫情之致病株)與SARS-CoV-2偽病毒顆粒(圖B)。研究團隊注意到SARS-CoV-2偽病毒感染後的冷光素酶活性較低,明顯與真實新冠病毒的傳染情況不同。經進一步確認,SARS-CoV-2偽病毒顆粒的S蛋白在外泌過程中已被弗林蛋白酶(Furin protease)切割修飾成S1及S2二個片段(圖C),導致感染效力差強人意的問題。由於S蛋白在錯誤的時間點被切割與感染力低下的問題,會使得初代SARS-CoV-2偽病毒在作為研發疫苗藥物的參考時,尚有很大的改善空間。

「SEM仿真病毒」誕生過程
針對偽病毒S蛋白的問題,最直覺的解決方法為修改序列,以避開弗林蛋白酶的活性,但刪改的序列越多將會與真實病毒越來越不像。於是,研究團隊將目光轉向大家較少關注、二個分子量很小的冠狀病毒外殼結構蛋白:套膜蛋白(Envelope protein, E)以及醣膜蛋白(Membrane protein, M)。在偽病毒外殼加入E跟M蛋白後,實驗的結果非常令人振奮:SARS-CoV-2偽病毒在有E跟M的情況下,不僅感染力大幅回升,且被弗林蛋白酶錯誤切割的片段也消失了。同時,經由穿透式電子顯微鏡的拍攝觀察發現,以S-E-M組成的偽病毒其S蛋白狀態維持良好,且更能夠在病毒的表面撐起冠狀立體結構,使得S-E-M病毒顆粒的外觀看起來像是小一個尺寸的新型冠狀病毒(圖D)。由於改版後的SARS-CoV-2 S-E-M偽病毒具備了新冠病毒全部的外殼結構蛋白,且讓弗林蛋白酶不在錯誤的時間點搗蛋,形成外型跟特性都更接近真實新冠肺炎病毒的病毒顆粒,因此將它命名為「SEM仿真病毒」。

賦予「SEM仿真病毒」這個名字的同時,除了利用穿透式電子顯微鏡觀測外形結構之外,也根據病毒生活史(圖E)設計實驗證明SEM仿真病毒與真實的病毒的相似程度。首先,從病毒與宿主細胞受器結合的層面來說,當抗體或血清和病毒共培養之後,會與病毒表面相對應的結構蛋白結合,阻止結構蛋白與宿主細胞受器結合,而達到抑制病毒感染的效果,稱之為中和試驗。團隊利用了康復者的血清比較SEM仿真病毒與真實新冠病毒的中和試驗,結果除了顯示二者的中和試驗趨勢呈正相關(圖F),SEM仿真病毒甚至比真實新冠病毒更為靈敏(圖G)。另外,當病毒與細胞表面的受器結合後,會誘發細胞進行包吞作用(endocytosis)而進入宿主細胞中,接著被細胞內的包吞小體(endosome)包裹後與溶小體(lysosome)融合,而溶小體內的酸鹼值較低,可幫助病毒顆粒進行脫殼作用,進而將病毒的核酸裸露出來進行病毒的複製。因此,研究團隊選擇使用一個已廣泛運用在探討病毒生活史前期的藥物奎寧(Chloroquine, CQ),CQ的作用正是抑制這個酸化過程,以達到抑制病毒感染的目的。實驗數據顯示,以CQ處理後的細胞能使SEM仿真病毒感染後的冷光素酶活性下降約五十倍,顯示SEM仿真病毒的感染方式與真實病毒相仿(圖H)。上述結果皆證實,所開發的「SEM仿真病毒」除了感染效力大幅提升、外形結構更像真實病毒之外,感染途徑以及病毒特性也與真實病毒極為相似。

「SEM仿真病毒」的優點
總結來說,本院感疫所團隊所開發的「新冠SEM仿真病毒」(文獻1)具備了以下優點:(一)具備新型冠狀病毒全部的外殼結構蛋白,病毒顆粒結構更加接近真實病毒的外貌;(二)不需要在棘蛋白的胺基酸序列上進行突變或刪除序列等修飾,研發疫苗或抗體時,辨識抗原表位(epitope)的範圍不受到限制;(三)高感染效力,可為中和試驗提供更大的有效判讀數據範圍,避免誤判具潛力的疫苗候選者。以仿真的技術模擬真實的樣貌,「SEM仿真病毒」在受限制的實驗環境下最佳化的還原病毒原始生物特性,可成為新冠藥物及疫苗研發測試時的有利幫手。

參考文獻:

  1. Wang, H.I., Chuang, Z.S., Kao, Y.T., Lin, Y.L., Liang, J.J., Liao, C.C., Liao, C.L., Lai, M.M.C., and Yu, C.Y. (2021). Small Structural Proteins E and M Render the SARS-CoV-2 Pseudovirus More Infectious and Reveal the Phenotype of Natural Viral Variants. Int J Mol Sci.22(16), 9087.
  2. Huang, Y., Yang, C., Xu, X.F., Xu, W., and Liu, S.W. (2020). Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol Sin.41, 1141-1149.
  3. Savarino, A., Boelaert, J.R., Cassone, A., Majori, G., and Cauda, R. (2003). Effects of chloroquine on viral infections: an old drug against today’s diseases? Lancet Infect Dis.3, 722-727.

 

文/圖:感染症與疫苗研究所汪欣儀、莊子萱研究助理、余佳益副研究員

Comments are closed.