新式共軛焦顯微平台之功能與應用介紹

在生物醫學的研究領域中,常用螢光標定各式各樣的分子,並記錄螢光探針的精確位置和濃度,以研究分子間相互作用,或者是探索生物微環境的變化;而今,在螢光影像的擷取上,共軛焦顯微鏡已澈底成為不可或缺的工具。近年來,共軛焦顯微鏡的技術在解析度和靈敏度方面已高度地發展;然而,目前螢光分子的擷取仍是以螢光波長作為偵測的依據,無法有效地觀察對於許多嚴重自體螢光或螢光波長相近的樣本。去(2021)年底本院核心儀器設施中心為幫助研究同仁改善此困擾,購置了新式共軛焦系統:Leica Stellaris 8。新式的共軛焦顯微平台則是在傳統螢光波長偵測的基礎上,利用了螢光分子的另一個獨特特性:螢光的生命週期(Fluorescence lifetime, FLIM),多增加另一種螢光分子的偵測系統TauSense。

何謂螢光生命週期
螢光的機制是分子吸收了激發光的能量後,電子由基態(S0)躍升到較高能量的激發態(S1),再回到穩定的基態,以光的形式釋發出能量。而由吸收了激發光至發出螢光的這段時間,即為螢光生命週期,一般是在數個奈秒(ns)的時間單位範圍之內。

螢光生命週期是每個螢光分子的特性,這樣的特性是時間的維度,和螢光光譜(波長)的特性是不同的。不同的螢光分子可能釋放出相同波長的能量,但螢光生命週期的時間是不同的,因此利用螢光生命週期可以在共軛焦影像的實驗上,加上時間的維度朝新的方向發展。

螢光生命週期(亦即螢光衰減常數fluorescence decay constant (τ))是每個螢光分子的特性,會因螢光分子的種類和環境因子而有所不同,與其他螢光偵測技術最大的不同之處是,螢光生命週期的特性並不會受到激發光源強度或偵測感測器的放大倍率而影響,造成測量結果的偏差。現今實驗室的高階影像設備皆以螢光波長作為偵測的依據,對於許多嚴重自體螢光或螢光波長相近的樣本無法進行有效的觀察,而藉由FLIM的技術可以協助觀察。此外,相同螢光分子的生命週期會因環境而有所改變,此處的環境是指極性、pH值、溫度或一些離子濃度(Ca2+、NADH、O2或Cl)等微環境因子,因此FLIM技術可用做環境改變的偵測參數。

記錄螢光生命週期需要使用脈衝式雷射(pulsed laser)為激發光源,雷射開始的時間點為計時的起始,接收到光子訊號為計時的結束,再重複激發累積光子訊號,最後測得螢光分子的平均到達時間(average arrival time)。

螢光分子的偵測系統TauSense介紹
新的Leica Stellaris共軛焦影像系統使用脈衝式白光雷射(pulsed White Light Laser)和Power HyD快速光子計量式感測器測得螢光生命週期,將螢光生命週期的影像技術匯集在共軛焦的工作流程中。Stellaris中的TauSense Tool是一套革命性的成像工具,以螢光生命週期為基礎,可以獲得功能性的成像。無論樣品或染色程序如何,螢光生命週期的資訊始終存在,TauSense即是用來獲取螢光生命週期資訊的工具。TauSense中的成像工具可以使用獨立於螢光強度的對比技術,使用基於螢光生命週期的訊息探索細胞環境中分子的功能,提高影像品質或分離光譜選項之外的螢光物質。TauSense Tool包含了以下介紹的TauContrast、TauSeperation和TauGating三種不同功能。

TauContrast:探討樣本中的微環境變化
許多螢光分子的生命週期會因環境條件(如pH值或離子濃度)而異。TauSense模式中的TauContrast則可即時提供這些功能訊息,例如:代謝狀態、pH和離子濃度等。TauContrast可產生以螢光生命週期為對比度的影像,其中每個像素包含有關平均光子到達時間以及螢光強度(光子計數)的資訊。

此項功能使觀察微環境中的變化變得容易,因為像素可以通過不同的到達時間進行區分,並可以根據微環境的影響(例如高鈣與低鈣條件)產生額外的對比度圖。例如,Ca2+離子的濃度會影響染劑Oregon Green的生命週期。因此,使用TauContrast取得Oregon Green的光子平均到達時間的資訊,可以反應鈣離子濃度的變化(如圖1)。這對於研究各種細胞類型中的鈣離子波或觀察活細胞中鈣濃度和鈣離子波的動態變化十分有幫助。

圖1:帶有Oregon Green的細胞在被刺激後的鈣震盪。TauContrast的變化記錄了每個細胞生命週期的反應。系列影像以4.5fps的速度記錄,圖表顯示不同細胞的TauContrast軌跡(不同ROI的數據以不同顏色區別)
Image Size: 256 x 256 像素
LUT (TauContrast): 0-4 ns

TauSeperation:區分光譜重疊的螢光資訊
光譜(波長)相近的螢光色原之間的相互干擾會完全掩蓋實驗中有價值的訊息。然而,即使二個螢光色原的光譜完全重疊,也有可能利用它們在螢光生命週期方面的差異區分來自每個螢光色原的訊號。

TauSense Tool中的TauSeparation利用螢光生命週期的差異區分光子是從哪一種螢光色原釋放出來。TauSeperation依螢光平均到達時間的不同產生獨立的影像。活細胞和體內成像中,使用其生命週期的特徵分離染料種類的潛力尤其重要,在這種情況下,可以在單個實驗中區分的可用螢光探針數量的限制減少了從單個實驗中獲得的訊息量。如圖2所示,mNeonGreen和Mitotracker green或SiR和NucRed,是二組具有非常相似光譜的螢光染劑,一般的共軛焦影像系統無法區分它們,但由於它們的螢光生命週期不同,透過TauSeperation可以輕鬆區分。

圖2:使用TauSeparation將二個螢光強度影像的光子分配給相應螢光色原,四個螢光色原(LifeAct-mNeon Green-Red、MitoTracker Green-Green和NucRed-Cyan、SiR Tubulin-Magenta)即使螢光的光譜重疊,使用TauSeparation可區分出不同的螢光色原訊號
NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta)
Courtesy: Max Heydasch, University of Bern, and Spirochrome

TauGating:提升共軛焦影像品質
許多組織可能會表現一些內源性自發螢光,而這些自發螢光常常會干擾實驗的螢光訊號。TauSense中的TauGating可用來消除不需要的背景,如自發螢光或反射光的訊號。Gating以螢光生命週期為基礎,可設定記錄的時間範圍,將不同時間的訊號排除,以排除不需要的背景訊號。例如,植物中葉綠體的自發光會干擾來自螢光蛋白的訊號,並限制可以從實驗中獲得的訊息量。TauGating可以快速掃描和去除螢光生命週期較短的葉綠體等背景自發螢光的訊號。

 

圖3左側:影像顯示一般共軛焦顯微鏡無法區別螢光信號和葉綠體背景自發光。圖3右側:使用了TauSense模式可區分葉綠體中的自發螢光(螢光生命週期較短,以藍色呈現)和來自細胞膜的所需螢光信號(綠色)

Stellaris 8 FALCON(FAst Lifetime CONtrast)是以高速的單光子計數為基礎,以全新的光電元件架構螢光生命週期影像分析系統,提供螢光強度影像外的另一個定量的訊息尺度,探索細胞上不同組成分子的空間分布與交互關係。並且更有效地消除螢光影像的背景雜訊,增加許多應用,包括FLIM-FRET、FLIP、新穎螢光染料的開發、細胞生理動力學,甚至包括半導體或新型生醫材料的開發。TauSense提供了共軛焦顯微鏡使用者一系列新的工具,目的在將螢光生命週期訊息的潛力放入平常熟悉的設定中,使研究人員可以探討額外維度的訊息,擴展共軛焦實驗的潛力,並最大限度地利用從樣品中可獲得的資訊。

期待此台新式共軛焦系統可以為同仁帶來更多在螢光影像上發展的可能性,相信由此項系統所帶來的新技術及功能應用,將能夠幫助院內研究人員開創新的研究方向,取得更佳、更豐碩的研究成果。

 

文/圖:核心儀器設施中心光學生物核心實驗室胡淑芬助技術師

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